近日，思勤医疗联合上海交通大学瑞金医院周隽教授，与北京大学深圳医院、中山大学孙逸仙纪念医院、河南省肿瘤医院等团队在BMC Biology上共同发表了关于循环游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）片段化形成机制的研究。该研究创新性地将凋亡细胞内形成的DNA片段与血浆中的cfDNA片段联系起来，采用全基因组低深度测序（shallow whole genome sequencing，sWGS）分析cfDNA片段化的生物学过程。指出哺乳动物的cfDNA图谱存在特殊性和保守性，通过对比健康人群和癌症患者的cfDNA片段化图谱的差异，为cfDNA片段组学的应用提供了新的见解，是思勤医疗在癌症早筛与监测研究中的又一重大突破。
Part.1 研究介绍
cfDNA主要指正常造血细胞凋亡时释放的片段。健康个体中cfDNA片段大小分布主要位于167 bp处，而肿瘤来源的DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）片段往往较短。因此片段组学也作为癌症患者的特征性指标，用于癌症患者的早期筛查和监测。
Part.2 研究设计
研究首先以人类造血细胞株HL60为模型进行细胞凋亡试验，结合sWGS技术分析HL60细胞凋亡的cfDNA片段化过程。然后对901名健康人、38只犬以及438名癌症患者（癌症类型为6种常见癌症：乳腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、胃癌）的血浆cfDNA片段进行对比分析。
Part.3 主要研究结果
1. 凋亡细胞的cfDNA片段化有两个步骤，在片段分布的不同位置形成主峰和次峰
研究首先以HL60细胞为模型，剖析cfDNA片段化的生物学过程。在不同条件下诱导细胞凋亡（血清饥饿（SS）、高密度（HD）、室温（RT）、凋亡诱导剂（CPT）），都发现了相似的凋亡DNA条带，DNA条带由一个、两个、三个、四个和多个核小体单位组成（图1 A）。这表明染色质片段化是细胞凋亡的特征。
RT诱导的HL60细胞凋亡会产生明显的梯状DNA条带（图1 A），因此进一步研究了不同时间点RT诱导的HL60细胞。结果显示，随着细胞的凋亡，DNA片段的条带越来越明显（图1 B）。
然后以高分辨率的sWGS（1×）分析HL60凋亡细胞的片段大小分布。结果表明，cfDNA片段大小分布的峰值主要位于~167 bp、~360 bp、~540 bp和~720 bp处（图2 A），分别对应一、二、三、四个核小体单位。
对HL60细胞上清液中cfDNA片段进行检测，发现了一系列明显具有10 bp周期性的峰（图2 B）。进一步的研究表明10-bp周期性的峰是由核小体产生的（图2 C）。
综上，凋亡细胞中的cfDNA片段化过程包括细胞内和细胞外的消化。细胞内的核小体以一个、两个、三个、四个和多个核小体单位被剪切，细胞外的核小体被分解为10-bp周期性亚核小体片段，在cfDNA片段大小分布中分别表现为主峰和次峰（图2 D）。
2. 哺乳动物的血浆cfDNA图谱具有独特性和保守性
通过sWGS技术对901名健康人类个体的血浆样本进行检测，发现cfDNA片段的主峰出现在167 bp（85.0%）处，另外三个峰值分别位于333 bp（12.1%）、527 bp（2.3%）和719 bp（0.4%）处，这分别表示单核小体、二核小体、三核小体和四核小体（图3 A，C）。除了四个主要峰外，还同时观察到明显的片段化特征，即10-bp周期性的小峰（图3 B）。
此外，还分析了血浆cfDNA片段5′末端序列的碱基含量比例。在cfDNA片段的5'末端的第一和第二碱基处都存在C-end富集现象（图3 D），这与小鼠中的发现一致[1]，并且在第一主峰（50–250 bp）的cfDNA片段也倾向于C-end（图3 E）。
进一步分析了来自38只健康犬的血浆样本，发现cfDNA分布图谱与人类基本一致（图3 F-J）。同时，有研究发现，在小鼠血浆中也存在相似的cfDNA片段化图谱[1]。
由此得出，cfDNA片段化图谱在哺乳动物中具有独特性和保守性。
3. 癌症患者cfDNA片段化特征与健康个体截然不同
研究对438名六种癌症类型患者的血浆样本进行sWGS分析。分析结果表明，与健康人相比，癌症患者中检测到的血浆cfDNA含量普遍较高（图4 A）。
为了更好地区分癌症和正常血浆中cfDNA图谱（图4 B），该研究建立了一个quantitative proxy，分别对11个最明显的周期性峰值进行评估。结果显示，除了50 bp的峰值外，与健康组相比，癌症组其他峰值的reads百分比均显著高于健康组（图4 C，D）。
研究还发现，癌症患者样本中倾向于C-end的cfDNA片段也显著减少（图4 E），这与Jiang等人[2]在肝癌中的发现一致。
基于这些观察结果可以得出，健康个体与癌症患者的cfDNA图谱存在明显差异。
Part.4 结论
本研究以HL60细胞为模型，将凋亡细胞释放的DNA片段以电泳条带的形式呈现，并与血浆中的cfDNA片段联系起来，利用sWGS技术剖析cfDNA片段化过程：在细胞内以（一、二、三、四个）核小体单位被剪切，然后在细胞外被分解为一系列10-bp周期性片段，在cfDNA片段分布中表现为主峰和次峰。然后，利用sWGS分析了人类和犬类的cfDNA片段化特征，发现哺乳动物中的血浆cfDNA图谱具有一定独特性和保守性，同时，健康个体和癌症患者的cfDNA片段化特征存在显著差异。因此，cfDNA片段化可以作为一个特异性的癌症指标，用于癌症信号的分析。
目前，思勤医疗已经将这一研究成果成功应用于思康宁（SeekInCare）®、思康安（SeekInCure）®、思康明（SeekInClarity）®及宠可欣（PetCanSeek）®四款产品，助力癌症早期筛查与监测。
Part.5 附文章链接
Part.6 参考文献
[1] Han DSC, Ni M, Chan RWY, et al. The Biology of Cell-free DNA Fragmentation and the Roles of DNASE1, DNASE1L3, and DFFB. Am J Hum Genet. 2020 Feb 6;106(2):202-214. doi: 10.1016/j.ajhg.2020.01.008.
[2] Jiang P, Chan CW, Chan KC, et al. Lengthening and shortening of plasma DNA in hepatocellular carcinoma patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 17;112(11):E1317-25. doi: 10.1073/pnas.1500076112.